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黃志偉aaaa,cas,自然結構和分子生物學 黃志偉教授課題組發現新型Anti-CRISPR並揭示其抑制Cas12a活性的機制

2019年04月02日 20時01分56秒sunbet手机版瀏覽次數:3061

sunbet手机版報訊(生命/文)4月1日aaaaa,生命學院黃志偉教授課題組研究發現了新型Anti-CRISPR蛋白aaaaa,並揭示其抑制type V型Cas12a活性的新機制aaaa。該項成果以《Anti-CRISPR蛋白通過乙酰化修飾type V型Cas12a使之失活》(An anti-CRISPR protein disables type V Cas12a by acetylation)爲題發表在《自然結構和分子生物學》(Nature Structural & Molecular Biology)雜誌上aaaaa,同時該雜誌的News & Views欄目作爲研究亮點對該成果進行了專題報道aaaaa。

CRISPR-Cas適應性免疫系統爲細菌和古細菌對抗噬菌體和質粒入侵提供了核酸序列特異性的防禦機制aaaaa。CRISPR-Cas系統分爲6個亞型aaaa,其中II型Cas9和V 型Cas12a(Cpf1)系統被廣泛應用於基因組編輯和多種多樣的生物技術應用aaa。在噬菌體感染細菌過程中aaaa,細菌的Cas效應蛋白Cas9或Cas12a在RNA指導下通過PAM-interacting (PI)結構域識別位於靶向雙鏈DNA的PAM序列並解旋靶向dsDNA的兩條鏈aaaa,從而Cas效應蛋白核酸酶結構域切割靶向dsDNA的兩條鏈aaa,抵禦噬菌體的入侵aaaa。作爲對CRISPR-Cas免疫系統的反擊aaa,噬菌體通過進化出anti-CRISPR蛋白逃逸細菌CRISPR-Cas防禦系統aaaaa。

課題組首先通過生物信息學方法尋找到一類anti-Cas12a候選蛋白aaaa,再通過生化和細菌實驗發現其中的一個anti-Cas12a蛋白AcrVA5具有抑制Moraxella bovoculi (Mb) Cas12a活性的能力aaaaa。但意外的是aaaaa,凝膠遷移實驗發現AcrVA5蛋白並不結合MbCas12a-crRNAaaaa,這個現象與以前研究發現的anti-CRISPR蛋白通過結合Cas蛋白阻止靶向DNA的結合或者阻止Cas蛋白核酸內切酶活性完全不一樣aaaa。他們推測MbCas12a的抑制活性可能是通過一種未知的酶修飾而實現的aaa。而通過對AcrVA5蛋白序列分析以及實驗發現AcrVA5蛋白具有乙酰基轉移酶活性aaaa,進一步的生化實驗證實AcrVA5蛋白通過乙酰轉移酶活性使得MbCas12a蛋白失活aaa。

課題組進而尋找AcrVA5在MbCas12a蛋白上的乙酰化修飾位點aaaa。這類乙酰基轉移酶通常修飾底物蛋白上的賴氨酸(K)殘基aaa,由於K635是MbCas12a的PI結構域識別底物DNA的PAM序列的關鍵氨基酸aaa,因此他們推測MbCas12a的K635可能是AcrVA5乙酰化修飾從而失活的關鍵位點aaaa。MbCas12a的K635R突變試驗證實該突變體活性不能被AcrVA5抑制aaaa,同時發現AcrVA5對另一Mb strain(Mb2)的Cas12a(識別PAM序列的關鍵氨基酸是精氨酸而不是賴氨酸)沒有抑制能力aaaa,這些實驗結果表明AcrVA5蛋白髮揮其抑制作用主要依靠乙酰化Cas12a蛋白PAM識別位點的氨基酸K殘基發揮作用的aaa。有趣的是aaaaa,Mb2Cas12a的R625K突變體的活性能夠完全被AcrVA5抑制aaaa,該結果結合質譜分析從而證實AcrVA5蛋白通過修飾MbCas12a蛋白的識別底物PAM的關鍵K635殘基使之失活aaaaa。而Cas12a蛋白的結構揭示K635的乙酰化不僅使dT2和dA(3*)之間失去氫鍵相互作用aaa,也可能形成空間位阻aaa,阻止了dsDNA的結合aaaa,從而使Cas12a失去dsDNA切割活性aaa。

該研究揭示的anti-CRISPR通過乙酰轉移酶活性修飾並抑制CRISPR蛋白的機制和該課題組以前發現的anti-Cas9的抑制機制完全不一樣aaa,anti-Cas9是通過直接結合Cas9的底物結合位點從而抑制Cas9的活性aaaa。該研究首次揭示了anti-CRISPR蛋白可以通過酶修飾作用抑制細菌CRISPR-Cas免疫防禦系統的新機制和策略aaaa,爲噬菌體和細菌免疫系統(CRISPR-Cas)之間的進攻防禦策略提供了新觀點aaaa。該發現可以用於在體內精確控制Cas12a的活性aaa,提高基因編輯的精確性aaaaa。這也是該團隊在病原與宿主相互作用和基因編輯分子機制研究領域取得的又一重要研究成果aaa。

黃志偉教授爲該研究論文的通訊作者aaaa,博士研究生董立永和關曉宇aaaaa,北京大學高寧組的李寧寧博士爲該論文的並列第一作者aaa。sunbet手机版張帆副教授、朱玉威博士對該研究做出了重要貢獻aaaaa。上海同步輻射中心爲晶體數據收集提供了支持aaa。本項目受到國家自然科學基金委、sunbet手机版青年科學家工作室等基金的資助aaaa。

文章鏈接:

https://www.nature.com/articles/s41594-019-0206-1 


編輯:閆明星

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